免疫信息学

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第一节 免疫信息学源流

上个世纪中叶充满科学传奇。那不只是个DNA双螺旋结构阐明、分子生物学产生与兴起的时代，也是系统论、控制论、信息论纷纷造成问世并引发全球普遍关注的时代，仍是电子计算机走进人类社会并产生重要影响的时代。香农发表了《通讯的数学理论》，奠基了他信息论之父的地位；维纳出版了专著《控制论-关于在动物和机器中控制和通信的科学》；贝塔朗菲出版了系统论的表明做《通常系统理论：基础、发展与应用》。信息科学与计算机注定从一开始就与生命科学有着千丝万缕的联系。维纳专著的标题就有动物一词，贝塔朗菲自己就是生物学家。也就在那时，计算生物学（Computational Biology）、理论生物学（Theoretical Biology）悄然问世。进入上个世纪八十年代，随着人类基因组计划的酝酿与实施，数据驱动的生命科学研究开始横扫一切，生物信息学应运而生，突飞猛进，并不断渗透或应用到生命科学各学科甚至信息科学的一些前沿领域。

免疫学也不例外，生物信息学与免疫学的交叉融合造成了生物信息学的一个分支学科：免疫信息学（immunoinformatics）。俄亥俄州立大学已故外科与病理学系教授、移植免疫学家Charles G. Orosz在本世纪初首先创造了immuno-informatics一词，并将其定义为研究免疫系统产生、传递、处理及存储信息规律的学科（the study of the principles by which the immune system generates, posts, processes, and stores information）[1, 2]。或许人类偷懒的天性使然，在第239期的诺华基金研讨会（Novartis Foundation Symposium）*上，以色列魏茨曼科学院计算机科学与应用数学系的Lee A. Segel教授省掉该词中间的连字符，immunoinformatics这一词汇第一次出如今文献中[3]。在这篇题为“经过扩散信息网络的扩散反馈控制免疫系统”的文章中，Segel教授在文中写道[3]：“

免疫系统是研究生物信息处理的绝佳对象。因为免疫系统自己极为有趣，加上它在医学上的重要性，所以，虽然还有许多研究要作，但免疫系统的硬件相对已研究得较为清楚。在分子水平，显著的高频体细胞突变改变了遗传信息，使B细胞受体更具多样性。然而，更为吸引个人是在细胞水平，由于我相信，这一水平的规律，不只决定免疫系统的行为，并且也能用于其它主要的生物系统，以及非生物的分布式自主系统。

脊椎动物拥有许多不一样类型免疫细胞，总数可达1018个，却没有明显的老王（Boss）。不一样类型的细胞群调动起来对付、攻击各类病原及毒株。此外，免疫系统也参与伤口愈合、组织重建等其它自身稳定任务。大量被称为细胞因子的信号分子指导着免疫系统。每种细胞因子具备几种功能，每种功能受几种细胞因子的影响。当配体与相应受体结合，一般分泌多种而非一种细胞因子。

这一超级复杂的分布式自主系统是如何肯定作什么，什么时候作，作到何等程度的？我将从各个方面讨论这一问题，着重强调信息的做用。我尤为要论证基于细胞因子的扩散信息网络（diffuse informational network）所起的决定性做用。这样，我也就回应了Orosz关于免疫信息学（immunoinformatics）关键做用的建议。其中，免疫信息学被定义为研究免疫系统产生、传递、处理及存储信息的学科。”

2002年10月，诺华基金会资助下的史上首次免疫信息学研讨会在伦敦召开，来自实验免疫学、理论免疫学、生物信息学等各个领域学者畅所欲言[4]。在此次会议上（即第254期的诺华基金研讨会），会议主席德国教授Rammensee提出：免疫信息学可分为硬的、半软及软的三个领域，硬领域主要指免疫学相关核酸、多肽序列等数据及数据库工做，半软领域指处理免疫数据的方法及各类预测算法、软件等，软领域指免疫相关数学模型及其它各种理论免疫学研究[5]。这次研讨会迄今，免疫信息学已通过十余年发展，已经成为免疫学、生物信息学、计算机科学相结合的前沿领域。

广义地讲，当前免疫信息学可大致如下两大领域：

一是人工免疫系统(Artificial Immune System, AIS)及其应用[6, 7]。所谓人工免疫系统是指根据免疫系统的机理、特征、原理开发的人工智能算法与系统，如克隆选择算法、B细胞算法、阴性选择算法、树突状细胞算法等。人工免疫系统已应用到聚类分类、异常检测、信息安全、智能优化、图像处理、机器人控制、网络数据及文本挖掘等众多领域。该领域学者主要来自计算机与信息科学背景，模拟免疫机制，构建新的算法来解决各类科学及工程实践问题。该领域的研究内容从字面上看，很是贴近免疫信息学，源自免疫原理，落脚于信息方法。因为笔者对此领域没有深刻研究，本章也再也不赘述。

二是计算免疫学（Computational Immunology）及其应用。全部应用数学、计算机、人工智能、生物信息学方法来处理免疫学数据、分析免疫学问题的研究都属于计算免疫学，具体内容涵盖：理论免疫学（Theoretical Immunology）分析，免疫相关数学模型，各种免疫相关数据库构建，各类免疫相关预测算法、计算工具、网络服务及其应用如计算疫苗学（Computational Vaccinology）[8, 9]、反向疫苗学（Reverse Vaccinology）[10, 11]、计算机辅助疫苗设计[12]、计算机辅助抗体设计[13]等。一言以蔽之，用计算的方法解决免疫相关科学或工程实践问题就是计算免疫学，这也是当前免疫信息学的主流方向[14]。有趣的是，这一方向的工做从字面上看，用“信息免疫学”一词或许更为贴切，即源自信息学方法，落脚于免疫学问题。本章将结合笔者的科研工做，主要介绍计算免疫学资源及其应用。

第二节 免疫信息学资源

所谓免疫信息学资源，主要是指免疫相关的数据集、数据库、单机及网络程序等可以给用户解决相关问题提供便利与帮助的数据资料和软件工具。实验免疫学家、生物技术企业、咨询机构等做为这些资源的普通用户，可能并不太关心相关数据库如何构建、程序算法细节，但须要了解到哪儿去找特定数据，对于特定问题，什么软件好用等等。对于生物技术专业的同窗——将来生命科学的研究者、生物技术的探索者、生物产业的创业者与经营者、政策的制定者与管理者，亦复如是。本节着重介绍开源、免费、共享、方便的网络免疫信息学资源。

一、免疫学数据库

在生物信息学研究中，构建专业的数据库、高质量的数据集是关键的基础性工做。没有相应的专业数据支持，后续研究工做没法开展。固然，有了数据仍不够，还必须有质控标准与措施来保证数据的质量，不然，生物信息学研究就是垃圾进、垃圾出。这就比如实验生物学研究，必须要有合适的模式生物及独到可靠的研究材料同样。

因为生物技术的飞速发展与信息技术的进步，海量的生物数据产生了，这就须要各类类型的数据库来存储、管理、检索各类类型数据，如核酸序列、蛋白序列、空间结构、表达谱芯片、网络与通路等。大量生物信息学数据库产生了，如GenBank[15]、UniProt[16]、MMDB[17]、KEGG[18]等。这些数据库固然也包含了部分免疫学相关数据，但构建专门的免疫学数据库对免疫学研究而言无疑更为专业与方便。自从1970年第一个免疫学数据库KABAT诞生以来，大批高度专注或涵盖普遍的免疫学数据库纷纷登场。本节咱们重点介绍几个重要的门户型综合数据库及一些具备历史意义或特点鲜明的专注型数据库。

（1）免疫遗传信息的门户IMGT[19]

IMGT数据库最初由Marie-Paule Lefranc (Université Montpellier II, CNRS) 建立于1989年，目前已发展成为全球免疫遗传信息的门户。IMGT是“免疫遗传学（ImMunoGeneTics）”的缩写，目前包括7个子数据库。这些子数据库可分为序列数据库(IMGT/LIGM-DB、IMGT/MH-DB、IMGT/PRIMER-DB、IMGT/CLL-DB)，基因数据库(IMGT/GENE-DB)、结构数据库(IMGT/3D structure-DB) 和单克隆抗体数据库(IMGT/mAb-DB)。IMGT/LIGM-DB是一个具备详细注释的人类和其余脊椎动物免疫球蛋白（IG）与T细胞受体（TCR）的序列数据库，目前收录了来自303个物种的16万多条序列。IMGT/MH-DB是一我的类主要组织相容性复合物（HLA）的专门数据库，其中包括世界卫生组织HLA系统命名委员会的官方序列；目前，该数据库服务器主机放在欧洲生物信息学研究所（EBI）。IMGT/PRIMER-DB是标准化的IG和TCR寡核苷酸探针或引物数据库；目前该数据库有来自11个物种的1864条记录。IMGT/PRIMER-DB提供的信息尤为适用于正常和病理状况下的IG和TCR的表达研究、单链抗体、噬菌体展现、基因芯片设计。IMGT/CLL-DB是一个新的数据库，主要收集来自慢性淋巴细胞性白血病患者的IG序列。IMGT/GENE-DB是人类、小鼠、大鼠、家兔IG和TCR基因的数据库；到目前为止，它收录了IG和TCR基因2893个、等位基因4139个。IMGT结构数据库收录IG、TCR、MHC空间结构及相关信息，目前有2686个记录。IMGT/ mAb-DB收录已上市及临床试验中的单克隆抗体、抗体-受体融合蛋白及其余免疫应用的融合蛋白，目前有单抗272个、抗体-受体融合蛋白18个，共计420个条目。此外，IMGT网站目前还提供了15个与数据库配套的在线分析工具。IMGT已普遍用于自身免疫、感染、肿瘤的相关医学研究、兽医学研究及抗体生物技术研究中。IMGT的全部资源均可经过其主页http://www.imgt.org无偿使用。

（2）免疫表位信息的门户IEDB[20]

所谓表位（epitope）就是抗原中能被免疫细胞特异性识别的线性片断或空间构象性结构，是引发免疫应答和免疫反应的基本单位。表位在免疫学基础与应用研究中具备核心地位，是疫苗、抗体药物、肿瘤免疫、移植免疫、超敏反应的结构基础。IEDB是免疫表位数据库（Immune Epitope DataBase）的缩写，建立于2003年。IEDB虽然不是最先出现的表位数据库，但在NIAID的资助下，通过10年的发展，它已毫无疑问地发展成为全球免疫表位信息的门户。目前IEDB收录的表位及相关信息涵盖除肿瘤和HIV之外的99%已发表文献。文本挖掘程序自动扫描了2200万多篇PubMed文摘；大量专家对其中13000多篇文献（含7000多篇感染相关文献、1000多篇变态反应相关文献、约4000篇自身免疫相关文献、1000篇移植免疫相关文献）进行了人工归类、信息提取与注释。到笔者撰写此节为止，IEDB已提取文献14718篇，收录了人类及其它各类动物识别的多肽表位92407个，非多肽表位1831个。IEDB还包含了直接提交及来自FIMM、TopBank等一系列MHC配体数据库的数据，共有MHC配体（抗原肽）214704条。IEDB收录的表位不只数量最多，并且质量最好，包含的表位相关的各类背景信息最为丰富，甚至连实验细节也不放过。此外，IEDB还提供了一些配套工具用于表位预测与分析[21]。全部IEDB数据及工具都可经过www.immuneepitope.org免费访问与使用。

（3）免疫多态性数据库IPD[22]

该数据库由安东尼.诺南研究所（Anthony Nolan Research Institute）#的HLA信息学小组与欧洲生物信息学研究所紧密合做，建立于2003年，旨在为研究免疫系统基因的多态性提供方便。IPD目前包括MHC、KIR、HPA、ESTDAB等四个子数据库。IPD-MHC数据库收录了大量物种的MHC序列。这些物种包括：家犬、狼、山狗，家猫，僧帽猴、狨猴、枭猴、松鼠猴、绢猴、叶猴、狒狒、猕猴、白眉猴以及其它猴类，倭黑猩猩、黑猩猩、长臂猿、大猩猩、猩猩等。ESTDAB是一个肿瘤细胞系的数据库。IPD最具特点的是KIR数据库和HPA数据库；KIR收录了人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体（Killer-cell Immunoglobulin-like Receptors, KIR）共614个各等位基因及相应蛋白质的序列；HPA收录了人类同种异体血小板抗原数据。这些数据库都可经过http://www.ebi.ac.uk/ipd无偿使用。

（4）HIV数据库

这是第一个面向病原体的数据库，收录得到性免疫缺陷病毒（HIV）的核酸序列、免疫表位、耐药相关突变及疫苗试验。其中，HIV分子免疫学数据库始建于1987年，由洛斯阿拉莫斯国家实验室开发，最初的目的只是提供一个已知HIV表位的全面列表，包括细胞毒性T细胞表位、辅助性T细胞表位和抗体结合位点。目前这一模式已推广到其余病原体，如丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）和出血热病毒（Hemorrhagic Fever Viruses, HFV）。HIV数据库提供了大量分析工具，如表位比对（QuickAlign）、PeptGen、基序检索（Motif Scan）、序列定位（Sequence Locator）、ELF（Epitope Location Finder）等等。QuickAlign可用于比对表位、功能域或其它任何感兴趣的蛋白质区域。PeptGen可建立蛋白质的重叠肽图谱，有助于多肽设计与表位肯定。基序检索工具可找出蛋白序列中具备某一指定HLA基因型、血清型或超型基序的亚序列。序列定位工具能给出用户序列相对于HIV参考序列（HXB2）或SIV参考序列(SIVMM239)的位置。整个项目受NIAID资助，全部数据及工具都可经过http://www.hiv.lanl.gov免费得到或使用。

（5）KABAT 数据库[23]

为了肯定抗体序列中的抗原结合部位，著名免疫学家Elvin A Kabat（1914-2000）和他的研究小组于1970年创立了KABAT数据库；这也是第一个免疫学数据库。如今的KABAT数据库包括来自许多物种的IG、TCR、MHC及其它免疫相关分子的序列。一方面，新的序列仍在不断加入KABAT数据库；另外一方面，该数据库相关信息分析工具也愈来愈多，这些工具包括关键词搜索、变异性分析和序列比对等。KABAT数据库及相应工具曾经能够从http://immuno.bme.nwu.edu免费得到；但如今只有付费注册才能使用。2003年之后，该数据库再也不更新，第一个免疫学数据库就这样在不适宜的商业模式下成为僵尸数据库。

    （6）SYFPEITHI数据库[24]

1999年，Hans-Georg Rammensee教授及其同事开发了一个关于MHC配体和基序的数据库—SYFPEITHI。该数据库的名字来源于第一个直接测序的自然MHC配体，即SYFPEITHI九肽；该配体洗脱自小鼠P815肿瘤细胞的H-2Kd分子。目前，SYFPEITHI数据库收录了来自人类和其余物种（如猿、牛、鸡、小鼠等）MHC-I 类和 II类配体的序列7000多条，基序200多种，全部的数据仅来源于文献。SYFPEITHI数据库工具可检索等位基因、基序、自然配体、T细胞表位、源蛋白质/物种及参考文献。数据库与EMBL和PubMed数据库有超连接。SYFPEITHI数据库提供了一个基于基序打分的表位预测界面，可预测人类及小鼠的多种MHC分子配体，经过www.syfpeithi.de免费在线使用。SYFPEITHI数据库的脱机版本，可在我的电脑或局域网内使用，但需付费（单机每一年3000欧元）。又一个具备历史意义的数据库在商业化模式中迷失。

    （7）未完待续

从半抗原小分子、佐剂、表位、抗原、变应原到抗体，但凡当前免疫学课本上有的，互联网每每已有相应数据库。例如：半抗原数据库（HaptenDB[25]），佐剂数据库（Vaxjo[26]）表位数据库（Bcipep[27]、CED[28]），保护性抗原数据库（Protegen[29]）、肿瘤抗原数据库（TANTIGEN、CIDB[30]），变应原及表位数据库（ALLERDB[31]、Farrp、InformAll[32, 33]、SDAP[34]），抗体数据库（SACS[35]、Abysis）等等，不一而足。从纸质版到电子版，从平面文件(flat file)到关系型数据库，从单机到网络，免疫学数据库通过几十年的发展，种类与数量愈来愈多，数据库的容量愈来愈大，结构也愈来愈复杂。除了这些数据库外，免疫学相关的测试数据集（Benchmarks）也是重要的资源。因为篇幅限制，咱们再也不列举免疫学数据库及数据集。好事者，可经过 Google等搜索引擎，Nucleic Acids Research、Database及其它专业期刊查询相关数据库与数据集。

2. 单机软件与网络程序

有了数据的支持，理论免疫学家就能够经过数学方法创建理论模型，进行模拟仿真；计算免疫学家则可在此基础上进行数据挖掘，创建新的算法，或用这些数据训练人工神经网络、支持向量机，创建新的预测模型并进行测试、评估与分析。这些模型、仿真、算法及预测器每每最终实现为单机或网络程序。如前所述，网络程序已经成为免疫信息学乃至生物信息学软件开发的大趋势，但出于数据安全保密等各类考虑，单机软件仍受一些公司与研究组的青睐。另一个趋势是数据库自带的分析工具愈来愈多，数据库与网络程序的界限日渐模糊。此外，很多时候，解决一个免疫学问题每每须要一系列小的软件工具与步骤，因为这些小软件大都是现成的，所以只须要进行系统集成，造成合理的工做流程便可，这样的工做可经过诸如Accelrys公司的Pipeline Pilot等平台来自动化。因为免疫学相关网络程序不计其数，本节再也不具体罗列，而在免疫信息学的具体应用中部分说起。

第三节 免疫信息学的应用

免疫学不只是研究分子识别与相互做用的基础学科，并且贴近应用。FDA近年批准进入市场销售或临床试验的药物中，新型抗体与新型疫苗屡拔头筹。因为抗体药物的巨大成功，以新型抗体、新型疫苗开发为核心的免疫学研究已经成为世界各国生物技术学术界与产业界全力追捧与投入的领域。与生物信息学相结合免疫信息学研究不只能够解决一些分子识别的基本生物学问题，并且也必将为产业界提供新的工具。免疫信息学资源已在生命科学基础研究与应用开发研究中普遍应用。这里，笔者结合本身的研究工做进行部分介绍。

1. 表位预测

表位预测是免疫信息学研究的核心问题之一，也是抗体、疫苗、移植免疫、变态反应计算分析的基础。所以，发现一个重要的新表位和发现一个新基因同样，都蕴藏着巨大的财富。所以，从IT巨人微软到世界500强的生物医药公司罗氏，都有人在作表位预测研究。1999年，纳斯达克上市公司Epimmune（Nasdaq：EPMN）将其发现鉴定的一个可能用于乳癌、肺癌、结肠癌治疗的候选"先导表位"做价200万美圆卖给了给美国Searle公司（世界500强的转基因寡头孟山都公司的制药部）。靠着它的另外一项专利成果泛DR表位PADRE，Epimmune公司还从Elan公司、Pharmexa公司得到了不菲的非独占受权费，然后，Genencor公司更为此付出了6000万美圆的独占性受权费；不只如此，Epimmune公司从此还将享有上述3家公司全部PADRE相关产品的销售提成。

回到现实，若是咱们将抗原比做一篇文章，那么表位就比如文章的关键词；而表位簇集区域就比如是摘要。根据表位特异性免疫应答的程度，可将抗原中的表位分为免疫优点表位、亚优点表位和隐性表位；根据表位对机体的影响，可分为保护性表位（免疫位）、致病性表位（变应位）、耐受性表位（耐受位）；根据识别的免疫细胞，可分为B细胞表位、辅助性T细胞（Th）表位、细胞毒性T细胞（Tc）表位等。表位预测就比如对抗原这篇文章进行钩玄摘要。目前有关研究主要是B细胞表位、Th表位、Tc表位的预测上。

   （1）B细胞表位预测

B细胞表位要被抗体识别，只能位于抗原表面。所以，早期的线性B细胞表位预测采用惟象方法（Phenomenological theory），经过计算蛋白亚序列的理化性质或二级结构，利用B细胞表位与上述理化特性或二级结构的相关性进行预测。例如，亲水的氨基酸更多位于液相面，而疏水的更多地深埋在抗原内核，所以能够计算蛋白质序列局部的亲水性来间接推断B细胞表位。对蛋白序列局部理化性质或二级结构倾向的理论计算大多依据相应的属性量表，这些量表可经过实验或统计分析获得。经常使用的量表如Janin可及性量表、Hopp和Woods亲水量表、Parker亲水量表（示例见图7-1）、Thornton突出指数量表、Welling抗原性量表等。30多年来，经典量表时有优化更新，对滑窗法的预测性能也有所改进。

图7-1 基于Parker亲水量表的线性B细胞表位预测示例

复杂网络（Complex networks）已经成为近年天然科学乃至社会科学诸多学科领域研究的一个焦点与超级热点。现实世界中的不少系统均可以用复杂网络的模型来描述与研究，如互联网、集成电路、电力网、通信网、铁路网、食物链、人际关系网等等。各类网络在数学上均可以用图（Graph）来表述。图论（Graph theory）源于18世纪大数学家欧拉（Leonhard Euler）对规则图（regular graph）的研究；20世纪50年代，两位匈牙利科学家Erdös和Rényi的研究使经典图论出现重大突破，确立了随机图理论（Random Graph Theory）。但无论是表征何种网络的图，它们都是由一些基本单元和它们之间的链接构成的；在图论中，咱们一般把前者称为节点（nodes）、顶点（vertices）或点（point），把后者称为边（edges）、链接（links）或者线（lines）。基于图论的系统生物学研究已经取得了许多重大成果，食物链网络、大脑皮层神经元网络、代谢网络、基因调节网络等许多生物系统的复杂网络已被证明具备小世界(small-world)或/和标度无关（scale-free）特性。在基因调节网络、代谢网络的研究中，蛋白质（或酶）被简单地看做为网络节点。可是，当把研究聚焦于蛋白质自己或其部分片断的时候，例如对蛋白质抗原，咱们一样能够把抗原看做一个复杂网络，一个大的“图”。它的节点是氨基酸残基，它的边是氨基酸残基之间在序列上与空间结构上的联系（如图7-2）。

图7-2：蛋白质抗原氨基酸残基网络示意图（家兔子宫珠蛋白: 1UTG）

咱们从PDB数据库中筛选出无冗于、高分辨率的表明性晶体结构640个，以氨基酸残基为节点，残基之间序列上的联系（实质是肽键）或空间上的联系（实质是二硫键等其它共价键或氢键、疏水相互做用、范德华力等非共价相互做用）为边，构建了640个抗原的氨基酸残基网络。计算这些网络中每一个氨基酸残基的链接度（Connectivity）、聚类系数（Clustering coefficient）、完形度（Closeness）、间度（Betweeness）等复杂网络参数，统计推演出基于复杂网络的4个新量表（见表7-1），即相对链接度（Rk）、相对聚类系数（Rc）、相对完形度（Ro）、相对链接度（Rb）。

表7-1 基于抗原氨基酸残基网络拓扑性质的新属性量表[36]

咱们把上述新量表用于基于滑动窗的B细胞表位残基预测。结果显示，在5个测试数据集中，相对链接度（Rk）表现稳定优越，在注释最完整、质量最佳的HEL数据集中，相对链接度的ROC曲线下面积最大，提示预测性能显著优于Parker亲水性(Ph)及Levitt指数(Li)等两个已知最好的B细胞表位预测量表（见图7-3）[37]。由于相对链接度反应了一个氨基酸残基在网络中相邻氨基酸残基数目的倾向。偏心在抗原内核的，邻居通常较多，在表面的，邻居相对较少。所以，用相对链接度来预测B细胞表位能有如此表现也就不奇怪了。

图7-3相对链接度、Parker亲水性及Levitt指数预测性能比较

专门的线性B细胞表位预测工具备PREDITOP、ADEPT、PEOPLE、BepiPred[38]等；一些综合性序列分析软件，如OMIGA、UWGCG、ANTHEPROT等，也包含了的线性B细胞表位预测功能。线性B细胞表位预测每每是根据蛋白质抗原的氨基酸序列，预测其上可能的B细胞表位区段。因为B细胞表位在没有其对应抗体时是不能肯定的，它的存在取决于相应抗体的存在，因此，从学术的角度，目前的线性B细胞表位预测彷佛是个伪命题。但就是这个命题倒是目前大部分抗体公司急需解决，有着重大现实需求的。例如，根据预测结果，用从自然蛋白中筛选出的合成肽段来免疫动物，以期得到的抗多肽抗体能与自然蛋白自己发生交叉反应。这具备重要的实用价值，相应抗体既可用于亲和层析，达到分离纯化完整蛋白抗原的目的，又可用于免疫组化或其它免疫反应而有助于基础研究与临床诊断，能够开发为科研甚至临床诊断试剂。当前，人工神经网络、支持向量机等机器学习方法已用于线性B细胞表位预测，但性能仍不使人满意。此外，基于噬菌体展现或抗原空间结构的构象表位预测近年来也广受关注。前者咱们将在后文中单独论述；后者包括Java语言编写的基于随机森林的单机程序Bpredictor[39]，网络程序CEP[40]、DiscoTope[41]及SEPPA[42]等。

   （2）T细胞表位预测

T细胞表位的预测研究肇始于对Th表位的预测。早期的Th表位预测明显受线性B细胞表位预测思路的影响，很多研究试图从实验证明的Th表位中找出它们在理化特性或二级结构上的共同特征并在必定程度上得到了成功，第一个Th表位预测程序AMPHI就是早期研究的表明做品。二十世纪80年代末90年代初， MHC-I类分子晶体结构的阐明和多种Tc表位基序的发现使Tc表位预测研究率先取得突破。这带动了MHC- II类分子晶体结构与各类Th表位基序的揭示，使Th表位预测摆脱了B细胞表位预测思路的影响。目前，打分矩阵、隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)、比较分子力场分析（comparative molecular field analysis, CoMFA）、比较分子类似性指数分析（comparative molecular silmilarity indices analysis, CoMSIA）、人工神经网络（artificial neural network , ANN）、支持向量机（Support Vector Machine, SVM）等各类方法都已用于T细胞表位预测。相关单机及网络程序包括AMPHI、Tepitope、TSites、EpiMer、EpiMatrix、BIMAS、MHCPred、NetMHC、NetMHCpan、NetMHCcons、NetCTL、NetCTLpan、NetMHCII、NetMHCIIpan、MetaMHC[43]、TEPITOPEpan等。这个领域很是热闹，因而该领域元老Brusic教授于2009年组织了首届机器学习在免疫学中的应用——HLA-I类配体预测（MLI）大赛[44]。行笔至此，2012伦敦奥运与第二届MLI大赛正如火如荼，发扬奥运精神，咱们也参与其中。但愿有兴趣的同窗从此能加入咱们。

虽然对Tc表位预测的探索起步最晚，但进展最快，研究最深刻，预测最成功，尤为是基于支持向量机的方法。目前，对Tc表位的预测，研究内容已经不仅限于对MHC-I类分子结合及其结合能力的预测，并且还拓展到对候选Tc表位天然产生可能性及其转运效率的预测，即对蛋白酶体酶切位点及抗原处理相关转运蛋白（transporters associated with antigen processing, TAP）的转运进行预测，范围涵盖整个抗原处理与递呈过程，相关程序如FragPredict、PAProC、NetChop等。此外，近些年的研究愈来愈重视杂合性T细胞表位、超型表位及表位簇集区域的预测。

2. 噬菌体展现

   （1）噬菌体与噬菌体展现

噬菌体（phage）是一类感染细菌的病毒。有些噬菌体，如丝状噬菌体M1三、fd、f1等，是很是好的表达载体[45]。经过基因工程方法，能够将外源基因片断或随机DNA序列插入噬菌体基因III或VIII中，表达后造成的融合蛋白仍可以自主装配成噬菌体外壳并将外源蛋白或多肽展现在噬菌体颗粒表面（见图7-4）。

图7-4：经过基因III或VIII展现外源序列的M13噬菌体示意图

噬菌体易于培养，增殖迅速。经过随机PCR等分子生物学技术，能够很方便地构建多样性从数百万到数百亿的噬菌体文库（phage library）[46]。这就使得生物学家能够像钓鱼同样，从“鱼塘”（噬菌体文库）里高效地钓到能与“鱼饵（bait）”结合的展现了特定多肽的噬菌体。一般，用来筛选噬菌体文库的物质被称为靶位（target）；靶位的自然配体称为模板（template）。如图7-5所示，使用靶位（如细胞、抗体、受体、酶、化合物、半导体材料等），通过几轮结合、洗脱、增殖的循环淘选（panning），一般能快速从噬菌体文库中筛出一系列可能与靶位特异性结合的噬菌体；经过DNA测序能快捷、可靠地推导出它们所展现外源多肽的氨基酸序列。这些能与靶位结合的外源多肽，一般模拟了相应模板的特定位点，于是被称为模拟肽（mimotope）；而上述得到模拟肽的分子生物学实验流程与技术则被称为生物淘选（biopanning）或噬菌体展现（phage display）[47]。

噬菌体展现技术一经问世便迅速发展，并在现代分子生物医学研究中普遍应用。在基础研究中，利用噬菌体展现技术能够预测出表位[48]、其余蛋白质相互做用位点[49]与网络[50, 51]，肯定药物做用的靶标蛋白；在应用研究中，噬菌体展现技术可用于开发器官靶向试剂[52]、新诊断试剂[53]、新生物技术药物[54]和疫苗[55]。尤为值得一提的是，噬菌体展现技术在基于新型生物材料的新能源如生物锂电池[56]、氢能源[57]等研究中大放异彩，美国总统奥巴马曾所以专程参观了麻省理工学院的相关实验室。

图7-5 噬菌体展现技术示意图（Science 2002）[58]

   （2）噬菌体展现数据中的信号与噪声

在噬菌体展现实验的结果中，信号是研究者想要获得的模拟肽序列，也就是能特异性结合靶位的多肽。可是，因为噬菌体展现技术自己固有的缘由，在淘选获得模拟肽的同时，也将不可避免地获得一些噪声序列，也就是所谓的靶位无关多肽（target-unrelated peptides, TUP）[59, 60]。这些噪声序列可分为两类。一类是选择相关TUP (Selection-related TUP, SrTUP)，专指发生在噬菌体的结合选择环节，可以结合筛选体系中某种成分但并不是与靶位特定位点结合的噬菌体展现多肽。因为靶位自己及淘选体系的复杂性，文库中的噬菌体除了与研究者期待的靶位位点结合外，还可能与淘选体系中的固相基质（如塑料和磁珠）、检测放大分子（如链亲和素、蛋白A）、封闭试剂（如牛血清白蛋白）、污染分子（如胎牛血清中的牛免疫球蛋白、大肠杆菌内毒素）及靶位的其它位点结合。另外一类是增殖相关TUP (Propagation-related TUP, PrTUP)，专指发生在噬菌体增殖环节，不是由于能与靶位结合，而是由于具备更快、更强的增殖能力而进入实验结果里的多肽[61]。与选择相关TUP同样，增殖相关TUP也极其常见，尤为多见于最为经常使用的基于M13噬菌体的Ph.D.系列商业化文库[62]。基于fd-tet噬菌体的文库增长了抵抗增殖相关噪声的设计；即使如此，增殖相关噪声序列仍不时出如今噬菌体展现实验结果中[61]。实验结果显示，增殖相关TUP不只可能混入噬菌体展现的结果中，有的时候甚至会主宰噬菌体展现数据[62]。计算机模拟结果显示，噬菌体增殖能力的差别即使微小到10%，通过几轮增殖后也能引发噬菌体文库克隆丰度的极显著差别[63]。所以，噬菌体展现的实验结果每每是模拟肽与靶位无关多肽的混合物。

若是不加区分，将噪声做为信号，也就是把噬菌体展现实验结果中的靶位无关多肽看成模拟肽，不言而喻，其研究结果每每是误导的和悲剧的。使人遗憾的是，这种状况至关常见。例如，全球有几十个研究组都报道过一种序列为SVSVGMKPSPRP的神奇“模拟肽”。汇总各研究组的实验结果，提示它可能与40多种不一样的靶位结合[64, 65]。这些靶位包括：多种器官与组织（如头发、皮肤、小鼠肿瘤血管、小鼠胚胎），多种细胞（如神经元、前列腺癌细胞、肝癌细胞、小鼠卵细胞、金黄色葡萄球菌），RNA，DNA，多种抗体，多种酶（如葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶），多种蛋白（如神经生长因子、艾滋病毒Vif蛋白），多种多肽及各类材料（如磷脂酰丝氨酸脂质体、脑膜炎球菌脂多糖、羟基磷灰石、聚四氟乙烯、墨水染料、单壁碳纳米管、钴纳米颗粒、铂铁合金及磷化铟、砷化镓、氮化镓等半导体材料）结合。难道SVSVGMKPSPRP是无所不能的万能胶水？实际上，上述多数实验里它只是一条增殖相关的TUP。然而，具备讽刺意味的是，至关多的实验小组把噪声做为信号，最终得出了一些错误的结论还如获至宝。

使人欣慰的是，在噬菌体展现领域，不管是实验研究者仍是理论研究者，都已经开始注意到实验数据中的噪声问题。在进行后续研究以前，颇有必要预先减小或尽可能消除实验数据中的靶位无关多肽，这已逐渐成为本领域研究者的共识。所以，靶位无关多肽的研究已经成为近年来噬菌体展现领域实验与生物信息学研究的热点。经过采起消减淘选（subtractive panning）、提升靶位结合选择的严谨度、减小淘选次数等各类实验措施，能在必定程度上减小选择相关及增殖相关噪声。可是，仅靠实验自己的改进并不能完全消除靶位无关多肽，这是由噬菌体展现内在的结合选择与感染增殖环节所决定的[63]。所以，借助信息学手段来检测噪声序列，进而对噬菌体展现数据进行计算纯化等一系列预处理，不失为省时、省力、省钱的上佳之选。

   （3）噬菌体展现数据预处理研究进展

目前，噬菌体展现数据的预处理方法大致可分为三类。一是是基于信息论的方法，二是基于TUP序列特征的方法，三是基于数据库搜索比对的方法[66]。

早在2004年，Mandava等就根据香农的信息论提出了用信息含量（Information content）这一指标来衡量噬菌体展现结果中每条多肽是信号仍是噪声[67]。对于噬菌体展现实验结果中任意一条多肽序列X1X2…XN，其出如今初始文库中的几率P = P1×P2×…×PN，其中PN表明着初始文库中某种氨基酸出如今第N位的频率。多肽的信息含量INFO =﹣㏑(P)。Mandava等所谓的信息含量相似于信息论中的信息熵（information entropy）。Mandava等认为，初始文库中越罕见的多肽，信息含量越高，通过几轮淘选还能出如今结果中，这就越不多是随机事件，这样的多肽应该是有意义的信号；反之，越是具备增殖优点的噬菌体，在初始库中就越常见，信息含量也就越低，若是出如今结果中则极可能是噪声序列。根据上述假设，他们开发了INFO程序[63]。

2010年，咱们研究组根据Menendez等的综述，总结了当时全部已知靶位无关多肽的序列特征，编写了一个基于TUP序列特征的靶位无关多肽检测、报告与滤除程序（SAROTUP，http://immunet.cn/sarotup）[68]。咱们的测试结果显示，给噬菌体展现实验数据增长一个基于TUP序列特征的预处理环节，不只能极大地提升Pepsurf、Mapitope等程序预测蛋白质相互做用位点的性能，还有助于基于噬菌体展现的候选疫苗筛选[68]。

为了检测不具有已知TUP序列特征的靶位无关多肽，咱们接着又构建了一个噬菌体展现实验结果的数据库（MimoDB，http://immunet.cn/mimodb），收集了全球各研究组利用噬菌体展现淘选随机文库的实验结果[64]。该数据库每季度更新，笔者成文时版本有数据1956套，多肽序列16500条，是目前世界上最大、最全的噬菌体展现实验结果数据库。去年末，咱们又开发了MimoSearch、MimoBlast等几个基于该噬菌体展现数据库的小工具。经过MimoSearch小工具搜索数据库，能够查看实验者提交的多肽序列是否与其它已发表的结果彻底相同。若是多个研究组在淘选实验中使用的靶位不一样却又获得了彻底相同的多肽序列，那么相应多肽很可能是噪声序列，即使它极可能不具有任何已知的噪声序列特征。经过MimoBlast小工具可对MimoDB进行全数据库序列搜索比对，不只能够找到与实验者提交多肽序列不彻底相同但高度类似的已发表结果,从而提示靶位无关多肽，还能找出与已知TUP高度类似的多肽从而推导新的TUP序列特征[65]。目前，这些基于数据库搜索比对的工具也已集成到了SAROTUP程序的2.0版中。

（4）基于噬菌体展现的表位预测[49]

因为模拟肽和抗原上的自然表位能与同一抗体结合，因此，一般认为，模拟肽及其所模拟的自然表位应该具备类似的物理化学性质和空间关系。这是目前全部基于噬菌体展现的表位预测方法共同的假设与前提。在这个假设与前提下，经过比对模拟肽序列（或一套模拟肽的共同序列）与抗原序列，抗原序列中与模拟肽序列匹配（一致或高度类似）的部分可能就是相应的自然表位。这种状况已获得很多实验结果的验证。可是，在针对蛋白质抗原的体液免疫中，所产生的抗体约有90%所识别的都是空间构象性表位；或者说与抗体结合的绝大多数自然表位在序列上都是不连续。所以，基于噬菌体展现的表位预测，在绝大多数状况下，模拟肽与抗原在一级结构上没有或者仅有很是低的类似性。所以，如何把模拟肽合理映射到抗原的空间结构上或分散的抗原序列中，就成为基于噬菌体展现的表位预测研究的核心问题。目前，相关算法、流程、单机及网络程序包括PEPTIDE、FINDMAP、EPIMAP、SiteLight、Mapitope、RELIC、3DEX、MIMOX、MIMOP、PepSurf、Pepitope、Pep-3D-Search、EpiSearch、MimoPro、LocaPep、PepMapper等[66]。

   （5）噬菌体展现免疫信息学研究感悟

回顾既往7年咱们在噬菌体展现领域的免疫信息学研究，咱们作了数据集、数据库、数据预处理软件、数据解析预测软件，咱们深深感觉到了计算的力量。仅以咱们的噬菌体展现实验结果数据库而言，这让咱们充分体会到为何Rammensee教授要将之称为hard了。数据的核实、提取及无休止的更正与更新，让数据库工做真的很是艰苦hard。固然，Rammensee教授的原意是指这些直接来源的实验结果的数据是如何hard，如何可靠；而创建在数据之上的算法与预测软件，那产出就软了，由于是计算预测结果，但好歹还可经过实验验证，因此就算个半软吧；至于没法实验验证的数学模型与仿真，那就全软了。这种认识，笼罩整个生物医学界，那就是：实验最可靠，实验是金标准；生物信息学，奇技淫巧罢了，计算的结果靠不住。可是，当咱们搜集全部噬菌体展现实验结果到MimoDB数据库中时，我遇到了实验研究的各类怪状；当全部噬菌体展现实验结果经过MimoDB平台能够相互对照后，咱们发现，实验结果也不都是可靠的，实验结果也不都是金标准，以子之矛、攻子之盾的地方实在太多。意外地，MimoDB能够成为一个噬菌体展现领域的循证生物学分析平台，能够帮助实验研究者消除实验结果中的噪声，这就是数据库的力量。

3. 在抗体研究中的应用

目前，有不少单机及网络程序可用于抗体的基础与应用研究的方方面面[13]。例如，使用Abnum可按Kabat、Chothia等三种方式给抗体序列定位编号，从而肯定CDR区[69]；使用SUBIM肯定抗体重链、轻链的亚类[70]；使用AbCheck检查提交的抗体序列中是否可能存在克隆伪迹（cloning artifacts*）或测序错误[71]；使用SHAB评估抗体的人源化程度[72]；使用PAPS预测抗体重链与轻链堆叠角度（VH/VL packing angle）[73]；使用AbM、WAM[74]、SWISS-MODEL[75]、PIGS[76]、RosettaAntibody[77]等创建抗体的三维结构模型。此外，计算方法也可用于抗体亲和力成熟、防止凝聚、延长半衰期的设计等各个方面[13]。

免疫信息学已经极大地改变了单克隆抗体产业。目前，抗体测序已成常规，而一旦有了抗体序列，就能够经过序列分析肯定其重链、轻链类型而无需实验确认；经过同源建模、分子对接及动力学等分析更能推断其相应抗原的大体状况。咱们与华西医大合做，对他们经过杂交瘤技术得到的抗苏丹红I单抗进行了免疫信息学研究，经过从头计算与同源建模相结合的方式，得到了其空间结构的理论模型（见图7-6）。该图左侧为抗体轻链，其绿色、水色、蓝色、紫色部分对应LFR、L一、L二、L3；右侧为抗体重链，其红色、水色、蓝色、紫色段分别对应HFR、H一、H二、H3。正中凹洞为抗原结合位点，凹洞底部主要由重链骨架区造成，侧壁主要由L3和H3造成。整个图像由经过PMV软件以分子表面的方式显示，其中分子表面用MSMS软件计算。

图7-6 抗苏丹红I单抗可变区空间结构理论模型

咱们在剑桥结构数据库（Cambridge Structural Database, CSD）中查询到的苏丹红I的晶体结构实验数据共4条，没有苏丹红II、III、IV晶体结构的实验数据。使用Gaussian软件，计算出苏丹红I-IV的空间结构。将4条实验验数据与理论计算的苏丹红I结构进行叠合，发现实验数据之间RMSD差异居然比与理论结果之间的差别还大，说明计算结果精确可靠。用Autodock4.1将理论计算的苏丹红I-IV结构与抗苏丹红I单抗模型进行了盲对接与定位对接，获得了苏丹红I（见图7-7）到苏丹红IV与抗苏丹红I单抗可能的结合模式。颇为有趣的是，苏丹红I、II与抗苏丹红I单抗的抗原结合位点对接结合时构象类似：“2-萘酚”（naphthalen-2-ol）基团在内，其他部分朝外；苏丹红III、IV与抗苏丹红I单抗的抗原结合位点对接结合时构象类似：2-萘酚”（naphthalen-2-ol）基团在外，其他部分在内。

图7-7 抗苏丹红I单抗-苏丹红I相互做用示意图

在上图中，抗体轻链绿色，重链橙色，均按卡通模式显示。根据CCP4软件包计算结果，苏丹红I在抗原结合袋中与轻链的H3四、Q8九、T97（绿字标出）及重链的V3七、W4七、E50、V9七、K9八、W103等主要经过范德华力相互做用，图中仅显示了这些残基中直接与苏丹红有范德华相互做用的重原子。此外，苏丹红I的N13原子与轻链T97残基的OG1之间距离2.69 Å，造成氢键（黄色虚线）。抗苏丹红I单抗与苏丹红II的相互做用与抗苏丹红I单抗-苏丹红I的相互做用很是类似，苏丹红II的N13原子与轻链T97残基的OG1之间距离2.67 Å，氢键更强，再也不另图显示。

咱们使用了SplitPocket[78]计算了抗苏丹红I单抗的抗原结合袋的体积以及苏丹红I、II、III、IV分子的体积。在抗苏丹红I单抗全部袋结构中，最大的袋位于抗原结合位点，咱们将其称为抗原结合袋。它的尺寸为 5.23 Å × 6.64 Å × 10.36 Å（宽×厚×深度），体积为359.56 Å3；而苏丹红I、II、III、IV分子的体积分别为228.28 Å三、261.12 Å三、323.76 Å三、356.56 Å3。因为已有的研究显示[79]：结合袋每每都要比配体大得多，配体极少可以占据整个结合袋，因此，以上计算结果显示，抗苏丹红I单抗的抗原结合袋容纳结合苏丹红I、II分子比较容易，而要容纳苏丹红III则有些困难，苏丹红IV则几无可能。这些结果，与对接结合能数据也是较为一致的。总之，咱们免疫信息学的计算分析提示：苏丹红I、II能与抗苏丹红I单抗的抗原结合位点结合，强度相近；苏丹红III可能有较弱的结合，而苏丹红IV不大可能与抗苏丹红I单抗结合。咱们的结果返回华西后与他们实验的结果不尽一致！他们的实验结果显示，抗苏丹红I单抗与苏丹红I亲和力最高，其次苏丹红III，与苏丹红II结合较弱，不结合苏丹红IV。是实验错了仍是咱们的计算不对？后来，咱们的合做者反复研究，发现当初结合实验时未考虑苏丹红I-IV之间溶解度的差别，纠正后的实验结果与咱们计算的一致。计算的力量，因而可知一斑！咱们也进一步仔细阅读他们的专利，发现免疫用的半抗原是苏丹红I修饰物（苏丹红I号-3-丙酸，Sudan1-C3）而并不是苏丹红I自己。Sudan1-C3与OVA、BSA等偶联后，除了桥联的羧基碳原子外，其结构比苏丹红I多了2个碳原子，而与苏丹红II 的一个甲基碳原子正好重叠，另外一个碳原子位置不一样。所以，Sudan1-C3与苏丹红I、II很相近，推测引发的单克隆抗体能与苏丹红I、II发生较强交叉反应。

咱们也曾对抗CD147的美妥昔单抗（metuximab）进行过同源建模，其理论模型见图7-8。该图左侧为轻链，其绿色、水色、蓝色、紫色部分对应轻链骨架区(LFR)、轻链互补决定区一、二、3（L一、L二、L3）；右侧为重链，其红色、水色、蓝色、紫色段分别对应HFR、H一、H二、H3。美妥昔单抗的抗原结合位点呈两端开放的扁槽状，L3和H3构成槽底，L一、L2构成左槽壁，H一、H2构成右槽壁，LFR2区的F49及HFR3区的R94残基也参与了造成美妥昔单抗的抗原结合位点。从图中不难看出，针对蛋白质抗原的抗体与先前针对化学小分子的抗体，它们所造成的抗原结合位点形态迥然不一样。对于任一抗体，经过建模后对抗原结合位点形态的观察，彷佛就能大概知道其所针对抗原的大体类型。计算之神奇，叹为观止矣！

图7-8 美妥昔单抗三维空间理论模型

4. 在疫苗研究中的应用

疫苗极大地促进了人类健康事业的发展。可是，人类的生命与财产仍面临巨大的威胁。这些威胁主要体如今如下五个方面。其一，是新的传染病病原不断出现，如埃博拉病毒、人类得到性免疫缺陷病毒（HIV）、新的传染性肝炎病毒、疯牛病病毒及SARS病毒等。其二，是一些为人熟知的人畜致病微生物不断产生新的变种或耐药性并再次成为人类生命的杀手与财富的终结者，如大肠杆菌O15七、结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒等。其三，是911后整个世界面临着日益严重的生物恐怖主义威胁，如911后的炭疽恐慌。其四，是大量疑难疾病急需新的治疗手段，如癌症的免疫治疗。其五，是对药品及疫苗自己生物安全性的担心，如传统疫苗一般使用某种疾病的减毒或灭活的致病原，但这仍可能形成疾病传播或中。正由于如此，人类社会才迫切须要更快地拥有更多、更安全、更可靠的新的疫苗产品。

就以疫苗最经典的应用领域——传染病预防为例，目前已明确的致病微生物超过400中，但只针对其中30多种开发出了上市的疫苗。所以，仍然大量传染病预防疫苗仍亟待开发。目前的疫苗研发已从传统的预防性疫苗发展到治疗性疫苗，适用范围从原来单纯的传染病预防发展到对过敏性疾病、自身免疫性疾病、器官移植性疾病、计划生育、免疫去势、不孕不育症、老年痴呆、肿瘤防治、戒烟戒毒等各个方面。随着人类基因组计划的完成与大量病原微生物基因组的阐明，人类已进入从基因组到候选保护性抗原到保护性表位到个体化定制疫苗的时代，免疫信息学在其中发挥着重要的助推做用。

例如，在表位疫苗设计方面，EpiVax公司设计了iVAX工具包。iVAX是一套根据蛋白抗原序列，设计表位疫苗的免疫信息学工具，包括Conservatrix、EpiMatrix、ClustiMer、BlastiMer、EpiAssembler、Aggregatrix和VaccineCAD等程序。其中，Conservatrix评估九肽片断在同一病原不一样毒株之间的保守性；EpiMatrix评估多肽片断的HLA-I、II分子结合能力；ClustiMer根据EpiMatrix输出肯定富含T细胞表位多肽群；BlastiMer评估这些多肽群与人类基因组间的类似性，类似的序列要么耐受难以引发免疫应答，要么形成自身免疫病，所以需去掉；EpiAssembler将保守、特异且富含T细胞表位的多肽群合起来；Aggregatrix肯定覆盖最多HLA型别，最多毒株病原的最小一套表位；VaccineCAD将候选表位多肽合理串接，避免因多肽链接造成新的表位。

疫苗研究在线信息网（Vaccine Investigation and OnLine Information Network, VIOLIN）也提供了大量疫苗研发相关信息，包括疫苗相关的各类数据库及程序[80]。其中，Vaxign是一个集成的反向疫苗学在线软件[81]。它包括两个部分：一是可直接查询预先已预测好的结果；二是对提交的新基因组或蛋白序列进行实时交互分析预测。Vaxign集成了一系列软件，包括：（1）肯定蛋白抗原亚细胞定位的PSORTb，分泌或病原外膜蛋白多是理想的候选靶标，而胞浆及内膜蛋白则不理想；（2）预测蛋白质跨膜方式的TMHMM，跨膜超过1次的蛋白难以克隆、表达、纯化，不适宜做为重组疫苗的抗原；（3）预测粘附及粘附样分子的SPAAN，粘附样分子的一般是理想的疫苗靶标；（4）预测MHC-I及II结合能力的Vaxitope，此软件由He研究组本身开发；（5）分析序列类似性的BLAST，与宿主高度类似的序列要么耐受要么致使自身免疫，不是理想的靶标。

最后，举一个实际案例。脑膜炎奈瑟菌是流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）的病原菌。根据其荚膜多糖抗原的差别，可将脑膜炎奈瑟菌分为至少13个血清型，其中致病的主要是A、B、C、Y及W-135血清型。迄今，A、C、Y及W-135血清型的纯化多糖疫苗已使用了多年，取得了较好的预防效果；但到目前为止仍然未能开发出针对脑膜炎奈瑟菌B血清型（MenB）的疫苗。缘由主要是MenB荚膜多糖一段与人唾液酸一致，其荚膜多糖不宜做为疫苗，而主要的外膜蛋白PorA变异度大，免疫后只能引发毒株特异性保护，不能预防全部MenB感染（见图7-9）。这样，MenB致使的流脑愈发常见，已占美国流脑的1/3，欧洲流脑的45%-80%以上，成为严重的健康威胁。2000年，MenB-MC58株的全基因组测序完成[82]，生物信息学方法马上用于预测其基因，免疫信息学方法马上用于预测、筛选保护性抗原[83]，预测与实验相结合，很快肯定了在外膜上含量相对较少、但更加保守的几个保护性抗原如H因子结合蛋白（factor H-binding protein, FHBP)、奈瑟菌粘附素A（Neisseria adhesin A, NadA）及奈瑟菌肝素结合抗原（Neisseria heparin-binding antigen, NHBA）等。正是因为采用了这种计算加实验的转化医学策略，目前，MenB疫苗已在上市审批中[84]。

图7-9 脑膜炎奈瑟菌B示意图

5. 在移植免疫中的应用

人工神经网络等机器学习方法已经用于移植免疫领域多年；例如，用于预测肝移植排斥、肝移植后他克莫司血药浓度、辅助诊断肾移植超急排斥、评估肾移植并发症、预测肾移植后巨细胞病毒感染、预测胰腺移植的预后等。器官移植，最重要的是HLA配型。然而，因为供者有限，在没有彻底匹配的状况下，如何从不彻底匹配的供者选出最合适、最兼容的。美国匹兹堡大学医学中心的Duquesnoy教授研究该问题10余年，开发了一系列基于EXCEL的宏程序HLAMatchmaker[85]。因为该程序要建立临时文件并要反复地在EXCEL表格之间剪切粘贴，既费时间又容易出错，所以Filho等最近开发了基于HLAMatchmaker的EpHLA程序，实现的分析过程的彻底自动化。[86]

6. 在变态反应防治中的应用

民以食为天。然而，自古以来食物过敏（food allergy）就一直困扰着人类。流传于民间和传统医学中的“发物”之说以及与之相关的种种饮食禁忌，在必定程度上反应了人们对食物过敏的经验认识。现代医学与免疫学研究代表，绝大多数食物过敏属于IgE介导的I型变态反应，通常表现为哮喘、腹泻、腹痛、荨麻疹等；但严重的也可能出现危及生命的、与青霉素过敏反应相似的过敏性休克。流行病学调查的数据显示，食物过敏在成年人中的发病率约为2 ~4%；而在儿童中则更高达8%；每一年每100万人中，约32人发生严重甚至致命的食物过敏[87]。随着转基因农做物的出现及其在食品工业中的普遍应用，公众对食物过敏的担心进一步加深。了解、获取食物过敏的相关信息已经成为公众的迫切需求。“新买的转基因玉米会不会有更高的引发食物过敏的风险？”、“我吃豌豆过敏，那吃山里朋友送来的土特产小扁豆会不会也过敏呢？”人们天然而然会有诸如此类的种种问题。也就是说，公众迫切须要一个与天气预报与预警相似的，使用方便、通俗易懂的食物过敏预测、预警与查询系统。

因为食物过敏极为常见，危害普遍，且与公众平常生活与健康息息相关，美国、日本、欧盟国家及相关国际组织如世界卫生组织（World Health Organization, WHO）、联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization, FAO）一直很是重视食物过敏及其防治研究。现代医学研究认为，食物过敏主要由食物中一些特别的蛋白质引发；这些引发过敏（变态反应）的蛋白质在免疫学中被统称为变应原（allergen）。目前，对食物过敏除了一些对症治疗外，并无根治措施。所以，避免接触或摄入过敏食物，从而预防食物过敏的发生就相当重要了。临床上，主要经过皮试和体外IgE检测来诊断食物过敏。然而，临床诊断用变应原的种类有限，而食物及其蛋白质组成却纷繁复杂。如何根据有限的实验结果，科学严谨地推断到更多未经实验检测的食品（包括转基因食品）中去，从而预测、预警其引发食物过敏的风险，这已经成为免疫信息学研究的一个前沿与热点。

这主要体如今如下两个方面：其一是1996年以来，大量变应原数据库及IgE表位数据库出现；其二是食物过敏预测方法日趋成熟。目前，食物过敏的免疫信息学预测已经发展出短肽匹配、序列比对、结构比较等3种不一样方法[88]。短肽匹配方法比较用户提交的蛋白质氨基酸序列与数据库中全部已知过敏原有没有8个连续相同氨基酸。若是有，则认为该蛋白质可能引发食物过敏。在美国、欧盟、日本，短肽匹配方法已经普遍用于转基因植物的安全评估中。序列比对方法采用BLAST或FASTA程序，把用户提交的蛋白质氨基酸序列与数据库中全部已知过敏原进行序列类似性的两两比对。2001年，FAO/WHO专家组推荐，两比对序列80个氨基酸残基的序列节段内，若是35%以上的氨基酸残基相同则预测该蛋白质可能引发过敏反应。新近的研究显示，两条比对好的序列中若有70%以上的氨基酸残基相同，则几乎确定会有食物过敏的发生。例如，Sanchez-Monge等报道，对豌豆过敏的18位患者同时也都对小扁豆过敏[89]。豌豆中的过敏原主要是豌豆种子球蛋白（vicilin）和伴球蛋白（convicilin）；而小扁豆的种子球蛋白与豌豆种子球蛋白有90%以上的氨基酸残基相同，豌豆伴球蛋白与小扁豆伴球蛋白之间，相同氨基酸残基超过70%。Beyer等报道[90]，14位对榛子过敏的患者中，12位经检测有能与11S榛子球蛋白结合的IgE。同时，这14位对榛子过敏的患者约有一半也对花生或核桃、巴西果、腰果、杏仁等过敏。这些坚果的11S球蛋白序列有45%~55%的氨基酸残基与榛子相同。本领域最新的研究思路是经过比较结构进行食物过敏预测。因为食物过敏主要由IgE介导，而大多数IgE识别的是变应原上的空间构象性表位；同时，大多数重要的变应原均可归结到少数几个结构家族，提示只要与已知变应原具备类似空间结构，即便氨基酸序列类似性程度低，也可能造成类似的空间构象性表位，并所以可能引起交叉的过敏反应。2005年，在西班牙召开了一场关于过敏预测方法的专题国际学术讨论会。与会专家一致认为， FAO/WHO专家组2001年推荐的双测试中，6连续氨基酸短肽匹配方法假阳性率高，不主张继续采用。对序列比对方法中的同率阈值，与会专家存在分歧，主流意见认为，FAO/WHO专家组2001年推荐的35%的阈值较为保守，但仍可在应用中继续检验。此外，与会专家还一致看好结构比较方法，但因为目前结构数据仍然缺少，同时尚未与序列比对相似的统一清晰的结构类似性指标，结构比较方法仍有待进一步研究。

药物过敏是另外一种最为常见的变态反应。最近，药物过敏有突破性发现[91]。至少有部分药物，如阿巴卡韦、卡马西平等致使严重甚至是致命的IV变态反应，其机制彻底不一样于传统观点。现已肯定，阿巴卡韦与卡马西平能分别结合到HLA-B*57:0一、HLA-B*15:02分子的抗原结合槽，从而使相应分子递呈抗原肽的特性发生改变，就仿佛用药后机体有了一个新的HLA分子，从而致使具备该HLA等位基因的患者发生相似器官移植不匹配的后果。从此，免疫信息学在预测药物过敏方面一定大有所为。免疫信息学还能用到什么地方？将来老是超乎想象。

脚注

* 诺华基金会是一个国际性的科学和教学慈善机构，它旨在促进生物学、医学和化学研究方面的合做。John Wiley从1986年起就是诺华基金会的出版商，出版了独一无二的、受到业界高度尊重的诺华系列丛书。这些书籍包括诺华基金研讨会的论文集，而且还汇编了主要科学家和学者演讲后普遍的鼓舞人心的讨论和辩论。这些珍贵的资源涵盖了20世纪后期全部关键的生物学发展，而且由国际知名的专家做为撰稿人，其中更包括不少诺贝尔奖得到者。生动的辩论加上撰稿人的国际地位，为诺华基金研讨会系列丛书赢得了在科学文献方面独一无二的尊贵地位。

 

^# 1971年Anthony Nolan出生并发现患有Wiskott-Aldrich综合征，只能经过骨髓移植治疗，但当时没有寻找除至亲以外的供者系统。1973年，世界上第一例无亲缘关系的配型与骨髓移植成功。居住在澳洲的安东尼妈妈雪莉.诺南(Shirley Nolan)看到了但愿，不远千里回到英国，呼吁国人踊跃验血，并于1975年催生了Anthony Nolan基金会，创建了世界上第一个骨髓资料库。惋惜，安东尼.诺南没有等到合适的供者，于1979年去世。1993年安东尼.诺南研究所建成；迄今已有职员171位，登记的供者已超过40万份。

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