扩增子分析解读1质控 实验设计 双端序列合并

本文采用目前最主流的扩增子测序数据类型HiSeq2500 PE250类型数据为例，结合目前主流方法QIIME+USearch定制的分析流程。本课程中所需的测序数据、实验设计和课程分析生成的中间文件，都可以直去百度云下载。连接：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密码：y33d

 

本课程代码的运行，至少须要Linux平台+安装QIIME 1

 

分析前准备

# 创建工做目录并进入，-p参数为若是文件夹存在不报错

mkdir -p example_PE250
cd example_PE250

# 建临时文件和结果子目录

mkdir -p temp result

 

1. 测序数据文件

16S扩增子测序数据主要来自HiSeq2500产出的双端各250 bp (PE250)数据，由于读长长且价格便宜(性价比高)。HiSeqX PE150和MiSeq PE300也比较常见，但PE150太短分辨率低，而PE300价格高且末端序列质量太低。此外454在以前研究较多但设备已经停产，PacBio读长长可直接测序16S全长1.5kb表明将来的趋势。

 

测序公司一般会返回raw data和clean data两种数据，raw data为测序得到的原始数据，而clean data则为去除含有接头序列及测序不肯定N比例较高的结果，一般直接采用clean data进行质量评估及后续分析。

 

质量评估经常使用fastqc，通常测序结果文件会附带评估报告，质量太差会重测，此步非用户必须

 

准备两个数据文件PE250_1.fq.gz和PE250_2.fq.gz至工做目录，一共600M，包括2,500,000条fastq格式的双端250bp数据。(提示：能够在Windows上下载，使用filezilla等工具上传服务器)

 

安装fastqc，己安装请跳过，未安装详见 http://www.cnblogs.com/freescience/p/7277556.html

 

若是系统中己安装过fastqc可直接运行fastqc -t 2 *.fq.gz便可。-t为设置线程数，建议与数据文件数量相同最佳，能够提升评估速度，*.fq.gz为输入文件，能够用*通配符指定多个文件。

 

运行结果每一个数据会生成两个文件，以下

PE250_1_fastqc.html # 网页评估报告

PE250_1_fastqc.zip # 网页报告相关文本和图片压缩包

数据质量以下：上为左端1-250质量；下为右端1-250质量分布箱线图

能够看到左端的质量比较高(图中绿、黄、红区域分别表明质量优、良、差)；右端序列末端质量较次，且箱体也进入红色差区，但中位数红线位于绿色高质量区。这样的结果已经算是中等偏上的了，在PE250测序中，右端的尾部质量都降低很严重，但只要左端的末端较好便可，双端序列合并可进行校订，通常均可以放心使用。

 

2. 实验设计文件

在QIIME中，把实验设计文件叫mappingfile，你们下载mappingfile.txt文件；本身的实验必定要按照示例的格式模仿填写，如错误后续没法运行。QIIME自带了个工具，能够检验文件书写是否正确。

# 先激活工做环境
source activate qiime1
# 关闭工做环境：不用时关闭，否则你其它程序可能会出错
source deactivate
# 验证明验设计是否有错误
validate_mapping_file.py -m mappingfile.txt

运行结果会输出三个文件

mappingfile_corrected.txt # 自动修正的实验设计，小错误会自动修改，但末必符合你的要求，不建议直接使用

mappingfile.html # 结果的错误报告，可下载查看网页，会高亮显示错误的位置

mappingfile.log # 运行结果报告

运行结果无误会显示 “No errors or warnings were found in mapping file.”。有错误建议查看生成的网页报告，高亮有错误的地方，自行修改后从新检测，直到无误。更多说明建议阅读帮助http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html

 

3. 双端序列合并

咱们首先的任务是把双端序列合并，根据两端序列末端的互补配对，能够合变为咱们扩增区域的序列，同时还能够对重叠区的质量进行校订，保留最高测序质量的碱基结果。使用join_paired_ends.py脚本，合并两个文件为单个。f/r参数为输入左和右端序列，支持压缩格式*.gz；m是选择方法，默认为fastq-join就能够了，也能够选择SeqPrep，更好但更慢；o为输出文件目录。更多说明建议阅读帮助 http://qiime.org/scripts/join_paired_ends.html

# 双端序列合并
join_paired_ends.py -f PE250_1.fq.gz -r PE250_2.fq.gz -m fastq-join -o temp/PE250_join

序列合并完，咱们会在设置的输出目录temp/PE250_join看到3个文件，以下：

fastqjoin.join.fastq # 合并成功的序列

fastqjoin.un1.fastq # 左端未合并成功的序列

fastqjoin.un2.fastq # 右端未合并成功的序列

咱们下游分析一般只对fastqjoin.join.fastq进行操做