TGCA数据的标准化以及差别分析--转载

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前面咱们从GDC下载了TCGA肿瘤数据库的数据,也可以把GDC下载的多个TCGA文件批量读入R

今天咱们讲一下TCGA数据的标准化，以及差别分析，获得了标准化后的数据，咱们就能够按照之前的帖子，作一系列操做

Y叔推荐的这个图有毒！

图有毒系列之2

多个基因在多亚组疾病中的展现

在获得了差别分析的结果后，咱们能够完成热图，火山图，GO分析，KEGG分析，GSEA分析，就跟这个帖子中的同样。
来完成你的生信做业，这是最有诚意的GEO数据库教程

下面开始今天的教程：
首先加载上一次课得到的数据；

### 加载数据
load("expr_df.Rdata")

如今的数据是这个样子的

处理前

去掉ensemble ID的点号

library(tidyr)
expr_df_nopoint <- expr_df %>% 
  tidyr::separate(gene_id,into = c("gene_id"),sep="\\.") 

如今的数据是这个样子的

处理后

去掉点号，是为了用gtf文件。
gtf文件的获取和做用在这里
GTF文件有什么用啊？别的不谈，最起码能提lncRNA

加载gtf文件,这是目前咱们能接触的最大文件，有260万行。

load(file = "gtf_df.Rda")

提取mRNA

mRNA_exprSet <- gtf_df %>% 
  dplyr::filter(type=="gene",gene_biotype=="protein_coding") %>% #筛选gene,和编码指标
  dplyr::select(c(gene_name,gene_id,gene_biotype)) %>% 
  dplyr::inner_join(expr_df_nopoint,by ="gene_id") %>% 
  tidyr::unite(gene_id,gene_name,gene_id,gene_biotype,sep = " | ")

最终获得19668行，这是编码基因的个数，如今的数据是这个样子的

编码RNA

提取lncRNA

这里颇有争议，而个人理由是，即便是编码基因，也会出现非编码转录本，而长链非编码RNA，指的是转录本，因此不能用gene的编码与否来界定

ncRNA <- c("sense_overlapping","lincRNA","3prime_overlapping_ncRNA",
           "processed_transcript","sense_intronic",
           "bidirectional_promoter_lncRNA","non_coding",
           "antisense_RNA")

LncRNA_exprSet <- gtf_df %>% 
  dplyr::filter(type=="transcript",transcript_biotype %in% ncRNA) %>% #注意这里是transcript_biotype
  dplyr::select(c(gene_name,gene_id,transcript_biotype)) %>% 
  dplyr::distinct() %>% #删除多余行
  dplyr::inner_join(expr_df_nopoint,by ="gene_id") %>% 
  tidyr::unite(gene_id,gene_name,gene_id,transcript_biotype,sep = " | ")

最终获得25530个非编码转录本，数据是这个样子的

非编码RNA

数据标准化

标准化和差别分析都是用Deseq2这个包来完成，首先要构建dds对象，构建这个对象须要两个文件，第一是输入数据，咱们已经有了，第二个是分组文件metadata，他至少由两列构成，一列是样本名称，一列是分组信息。

首先把样本名称变成数据框格式

metadata <- data.frame(TCGA_id =colnames(expr_df)[-1])

分组信息包含在TCAG_id的第14,15字符颇有用，他指示了样本是癌症仍是癌旁或者是转移 病灶

官网解释以下,01-09是癌症，10-19是正常，20-29是癌旁

Tumor types range from 01 - 09, normal types from 10 - 19 and control samples from 20 - 29

TCGA barcode的详细信息以下：

同时咱们要注意，即便是肿瘤组织，01-09意义各不相同，好比，01表明原发灶，02表明转移灶，详细信息以下：

咱们用table这个函数统计一下脑胶质瘤GBM样本的分类

table(substring(metadata$TCGA_id,14,15))

有154个是原发灶，有13个是转移灶，很奇怪是吧，没有癌旁。可是这个是能理解的，人的大脑正常组织是有用的，不一样于肝脏这类奇怪多一块少一块无所谓，切取大脑正常组织是没有伦理的。实际上TCGA里面还有一部分肿瘤是没有癌旁的，好比，淋巴瘤。

这一部分没有正常对照的肿瘤如何进行差别分析呢，一种方法是，使用GTEx数据库中的正常组织，这个咱们留一个坑，之后再讲。

可是，今天咱们的活仍是要作，咱们就用复发和非复发来区分便可。

sample <- ifelse(substring(metadata$TCGA_id,14,15)=="01","cancer","recur")
## 这里的factor是为了dds的须要
metadata$sample <- as.factor(sample)

此时metadata是这个样子的

构建dds的两个文件所有准备好，咱们开始下一步

mRNA标准化

这一步是为了代码复用，把counts文件统一命名

mycounts <- mRNA_exprSet

构建dds对象，若是mycounts中的TCGA_id是行名，tidy这个参数设置为FASLE

dds <-DESeqDataSetFromMatrix(countData=mycounts, 
                             colData=metadata, 
                             design=~sample,
                             tidy=TRUE)

Deseq2分析，这里面有不少步骤都本身运行了，这一步十分耗时，取决于样本数以及电脑内存大小，个人16g内存电脑运行5分钟，而个人学员们有的人要运行20个小时。甚至，若是，你分析的是乳腺癌，1000多个样本，小电脑根本过不去，此时，你能够考虑升级一下装备。

dds <- DESeq(dds)

这个数据很重要，并且有些人得到也不容易，因此，须要保存一下,方便之后使用。

save(dds,file="mRNA_exprSet_dds_sample.Rdata")

vst标准化,这一步跟上一步同样，速度取决于样本量和电脑

vsd <- vst(dds, blind = FALSE)

为何选择vst呢？看这个
转录组的高级分析前该如何标准化数据？
Deseq2标准化的原理是什么，youtube上的StatQuest小哥视频说的特别好，能够看看这个帖子
DESeq2的标准化方法

这时候，Deseq2还内置了主成分分析来看一下样本分布

plotPCA(vsd, "sample")

从图上咱们能够看出，原发灶和转移灶，并不能完美分开，生物学意义就是，转移灶不是新的类型的肿瘤，他实际上仍是脑胶质瘤，后续可能发生的结果是，下游额差别分析接结果很差，可能的解决方法是，找出配对的原发灶和转移灶来分析。咱们看结果来讲话。

获取标准化后的数据,这一步还会自动过滤掉不符合规定的基因，这时候，数据明显被标准化了

mRNA_exprSet_vst <- as.data.frame(assay(vsd))

标准化以后

保存一下这个数据，调整一下格式，就能够用于本文开头说的那一系列操做。

save(ncRNA_exprSet_vst,file = "ncRNA_exprSet_vst.Rda")

差别分析

这里用到前面保存的dds,使用results函数提取

res <- results(dds, tidy=TRUE) 

咱们看到这个数据，有foldchange值，有pvlaue，那么筛选差别基因，热图，火山图，GO，KEGG分析，GSEA分析就瓜熟蒂落啦。