Fastq2VCF传统流程

1.序列QC：

去除低质量reads，和连续的低质量片断，去掉接头序列。QC统计reads数量及测序质量。

2.Mapping：

因为bwa能准确，快速的将短序列比对到基因组上，并且软件持续更新和说明文档完备，是外显子捕获测序的首选。

3.Sam到bam转换：

Samtools 的多种工具能够将sam文件转换为bam文件，rmdup工具能去除PCR扩增产生的冗余reads，消除因为文库扩增而导入的突变，下降假阳性。

Flagstat统计reads的mapping状况以及比较去除duplicate先后reads数目的反映样品建库的冗余状况。

Picard提供的多个工具，修改bam文件，是之适合于后续的GATK软件包中的工具的处理。

4.Indel区域的reads从新作局部多序列比对：

在indel的边缘，一些错配看起来很像是SNP，经过对dbSNP库及bam文件检测到的indel附近的reads进行局部的从新比对，能够消除indel周边的假阳性SNP。

5.碱基质量从新打分：

测序仪给reads中的碱基的qual值存在必定的误差，经过经验的错误模型来从新计算的碱基的qual值，从新给reads的各个碱基的qual打分。

6.Call snv和indel：

对处理好的多样品bam文件同时运行UnifiedGenotyper，大大提升call SNP的灵敏度和准确性，多样品同时比较的结果，方便了后续的样品间差别的筛选。

7.突变位点的从新打分：

经过hapmap，omni，dbsnp数据库中已知的突变位点建模优化，对各个突变位点从新打分，筛选。大大下降了假阳性率。

8.注释：

经过ANNOVAR软件对vcf结果注释，关联到多个数据库。

 

2、数据分析内容

1. Mapping统计：

统计总reads数，mapped reads及unique mapped reads数目及百分比。

2. 捕获效率统计：

统计来自捕获区域的Fragment比例：

 

统计target区域全部的碱基覆盖次数分布：

对每一个target区域的覆盖和深度统计：

若是对某些基因特别感兴趣，想要看看来自这些基因的外显子区域的覆盖状况，能够提供每一个target或者特定target区域的覆盖状况和测序深度统计。

3. Snv和indel关联数据库：

Snv和indel结果按照突变的位点是否在捕获的区域以内分红两部分：

*_target.snv：突变处于捕获的靶区域(target region)内。

*_off_target.snv或者*_target.indel: 突变在捕获的靶区域以外。

Snv和indel结果与如下的数据库关联，为突变的筛选提供大量的信息。

1）基因注释：

经过基因注释能够达到如下的目的：突变的功能定位(在外显子，内含子，剪接位点仍是基因间区)；突变所在的基因名称或者临近的基因；突变若是在编码区域，是否引发氨基酸的改变(同义突变，非同义突变的呢过)。

如 果引发氨基酸的改变，按照HGVS命名规则表示--改变的基因ID，转录本ID，外显子编号，以及氨基酸改变，如 NOD2:NM_022162:exon8:c.G2722C:p.G908R。

默认使用refSeq完成基因注释，若是有特殊的要求，可使用UCSC known gene，Ensembl，GENCODE，CCDS等基因注释系统。

2） 1000G注释：

检测突变位点是否在1000 Genomes Projects（2012 release）数据库中检测到，若是检测到，显示等位基因频率（allele frequency）。默认是使用全部人种的数据库，若是有特定要求，能够按照要求展现不一样人种（好比AMR, AFR, ASN，EUR，中国人，日本人）等位基因频率。

3） dbSNP注释：

检测突变是否在dbSNP数据库中，若是在，显示rsID。

默认使用db SNP135数据库,若是有特定的要求，可使用dbSNP129，dbSNP130，dbSNP131，dbSNP132数据库。

4） AVSIFT：

SIFT是一款很受欢迎的检测非同义突变位点重要性的软件，对应非同义突变位点，会给定一个打分，若打分低于0.05，则代表突变极可能会影响到蛋白质的功能

5） 与UCSC的数据库的关联：

ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/.txt.gz,提供了大量的基因组注释信息，目前关联的数据库有：

tfbsConsSites：在人/小鼠/大鼠中保守的转录因子结合位点，以transfac Matrix Database (v7.0)为基础。

wgRna：snoRNA and miRNA注释。

targetScanS：TargetScan预测的miRNA把区域。

gwasCatalog：已经发表的各类疾病的GWAS结果。

genomicSuperDups：基因组中的重复片断。

phastConsElements46way：经过phastCons对脊椎动物的全基因组比对生成的保守区域，根据用于比对的物种数目，分为17way, 28way, 30way, 44way等。

6） cosmic63：

已观察到的癌症相关突变，显示在COSMIC中的ID（identifiers），观察到的次数，以及观察到的癌组织。

4. CNV：

XHMM是一款外显子捕获拷贝数变异检测的优秀软件包，使用GATK和XHMM可以获得较好的外显子捕获的CNV结果。

5. 其它：

Polyphen-2 (Polymorphism Phenotyping v2)也是一款基于多序列比对和蛋白质3D结构，预测氨基酸替换(从一种氨基酸改变为另外一种氨基酸)对蛋白质结构和功能影响的软件。

 

能够经过GT（genotype）直接比较样品间的差别(GT简介：0表示与Ref相同，1表示与ALTS第1个碱基相同，2表示如ALTS第2个碱基相同)。

经过和多个数据库的提供关联精细筛选条件：

如今咱们来看Fastq2vcf。能够流水化做业哦，省去以上多步骤的麻烦。

Fastq2vcf须要两个文件：一个描述排序数据的数据表和一个配置文件，用于生成一系列能够直接在Linux / Unix环境下运行的shell脚本。测序数据表包含有关样品标识符，平台，库，读取组，序列类型（配对结束或单端），目录和文件名的信息。用户可使用电子表格程序或文本编辑器构建该表格，并将其保存为制表符分隔的平面文件。配置文件存储数据分析工具和程序参数的路径。配置fastq2vcf后，运行它将生成三类shell脚本文件，这些文件能够自动执行分析管道中的全部步骤。一个典型的流水线如图1所示，显示了fastq2vcf的输出，三种shell脚本文件，以及这些shell脚本的功能。首先，QC_mapping.sh包含用于调用质量控制和对齐程序的命令行，并格式化数据以供进一步处理。第二个，PreCalling.sh，包含删除重复数据和从新排列以减小误报的命令行。第三个脚本文件Variant.sh包含用于变体调用，过滤和注释的命令行。