（基因功能 & 基因表达调控）研究方案

作了很久的RNA-seq分析，基因表达也在口头溜了几年了，但彷佛总是浮在表面。

对一件事的了解程度决定了你的思惟深度，只想作技工就不用想太多，想作大师就必定要刨根问底。

总是说基因表达，那么什么是基因表达？咱们测序获得的基因表达其实只是一种表型，是样本的一个快照，和普通的身高体重之类的连续型表型相似。

常规的转录组分析本质上都是表型分析，clustering、pseudotime、DEG、marker，在这些分析中，每一个基因都是独立的维度，属于静态的分析，此时咱们关注的是某个基因的功能分析，好比RET，功能已经明确，那就能够用基因表达这个表型来解释另外一个表型。

高通量测序还会有后续的分析，几万个基因不可能一个一个的研究，GO和KEGG分析就来了，基因不是互相独立的，GO term和pathway的概念就来了。GO和KEGG的本质是规范了基因之间的关系。GO整合了全部物种，是从生命系统的角度来统一基因的关系，这种关系只是一个集合；KEGG是针对一个物种来界定基因之间的关系，这种关系是有向图结构。必须再深刻了解GO和KEGG的制做原理，暂时不深刻。此时咱们开始区分基因类型，蛋白编码、非编码、转录因子。在这个阶段咱们更关注的是基因之间的调控关系。

中心法则揭示了生命系统的层级和管道结构，和计算机的通讯系统很相似，就算上游的基础调控再复杂，下游的蛋白都是决定性因素，因此使人惊叹的是上游调控如此复杂多变，可下游的蛋白确是很是稳定，这说明复杂多变的调控是很是稳定的。

 

基因研究的第一步必然是基因的功能，其次才是基因的调控。

 

基因功能 

那么如何研究一个基因的功能呢？参考：＃基因组观＃基因功能研究的“七大绝招”与“三板斧” - BioinforCN

简单总结一下这篇文章：

1. 天地人和，研究基因表达的时空规律来推测功能，这和侦探调查是同样的，属于间接推理；

2. 患得患失，就是直接操做基因，knock out或down或overexpress，来直接探索基因的功能，属于直接观察；

3. 上下求索，由于中心法则是个层级和管道系统，上下游十分明确，从基因的DNA、RNA到蛋白质，一块儿研究；

4. 十面埋伏，立体论证，作生物的很容易观察到假阳性，必须多角度论证；

5. 其余的，misexpression、in vitro/vivo。

 

不说人类hs了，假设你负责一个全新的物种的基因组和基因功能研究，你如何找到该物种的全部基因呢？

看任何一篇基因组组装文章都能找到解决方案。那咱们就看看严建兵的最新的玉米的NG吧，Genome assembly of a tropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement。

微信文章：《Nature Genetics》| 玉米产量相关基因找到了 | 热带玉米基因组及高精度结构变异图谱成功构建，助力玉米遗传改良

首先是基因组DNA的组装，Genome sequencing, assembly and scaffolding，这部分纯技术，之后估计都不要组装了，直接把基因组测出来；

其次就是基因组注释了，Genome annotation，这部分是咱们如今最感兴趣的部分，如何找到一个新物种内的全部基因？

A comprehensive strategy combining de novo gene prediction, protein-based homology searches, RNA sequencing (RNA-Seq) and isoform sequencing (Iso-Seq) of nine tissues (Supplementary Table 6) was used to annotate the genes (Supplementary Fig. 7).

方案来了：

1. 基因是有特殊结构的，因此只要有DNA序列，就能够作denovo预测；

2. 中心法则告诉咱们DNA、RNA和蛋白质是环环相扣的，全部测RNA-seq和iso-seq能够间接推出基因；

3. 蛋白测序尚未普及，因此目前都用的同源蛋白序列来反推；

这样注释出来的只是很general的基因注释，能cover绝大多数基因，但某些特殊结构的确定没法注释出来。

有了草图，后面再作实验的功能研究就会方便不少。

基于高通量测序的前两步只能告诉你基因组的这个地方是个基因，可是不可能告诉你它的功能；第三步就是基于已有的知识了，作同源推理。因此目前来看全部的生物知识都是来源于实验的，测序只是一个加速的辅助手段而已。

能够没有测序，可是不能没有实验，测序是科研加速的催化剂。

文章结果：

 

GENE FINDING METHODS - broad institute - 很全面

 

基因表达调控/转录调控

教科书解释：

1. 染色体和染色质水平的结构变化，致使基因活性变化；Hi-C，bulk平均好些，sc的量太少不靠谱
2. 转录水平调控；转录因子，enhancer，promoter，ncRNA
3. RNA加工水平调控，剪切修饰编辑降解；甲基化，lncRNA抑制降解
4. 转录后，细胞核向细胞质转运；HDAC4
5. 翻译水平；
6. 蛋白合成水平；蛋白修饰定量，不是AA测序

目前最火的两个能够用高通量测序研究的调控方法：

• 转录因子，enhancer，promoter
• 非编码RNA，lncRNA、miRNA、ceRNA

参考：

Modes of transcriptional regulation

Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease

 

项目问题：

如今in vivo和in vitro模型都已成熟，RNA-seq成本你们均可以接受了，CRISPR技术也成熟了，KO一个基因已经变得很是容易，如今发育生物学、生物医学等都在这么作：KO一个基因，来探索本身感兴趣的生物过程发生了哪些变化。 

如今问题来了，KO后表型确定发生了变化，那么如何把这个表型和基因表达和调控联系到一块儿呢？

这是一个general的问题，解答好了能够用于任意一个基因的深刻研究。

大致解决方案：

假设检验是科研获取真知的惟一手段，首先咱们必需要一个合理的假设，而后去寻找各类证据来test这个假设。

没有假设和验证就不是作科研，那就是一个技工得出一份没有意义的结题报告。 

 

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问题：

1. RNA-seq的建库方案有哪些？ployA、随机等。只抓有polyA的MRNA会有哪些优点和缺点？ployA只有mRNA有，因此polyA建库只能抓到蛋白编码基因，不多部分地ncRNA。参见连接

2. 细胞核和所有测序的区别？

3. 基因的长度差异到底有多大？

4. 可变剪切和isoform是如何影响蛋白的？

5. KEGG里面已经有基因的关系了，为何咱们还要研究基因调控？

6. 蛋白互做网络的用途和局限性是什么？

7. 蛋白是惟一的决定性因素吗？是的，绝大多数DNA和RNA层面的变化都会最终改变蛋白的功能。好比HSCR的没法造成ENS就是一个复杂的表型，能够确定的是某些蛋白的功能执行紊乱了。

8. 基因表达的高低重要，仍是基因表达的on/off重要？

9. 基因是如何找到和定位的？基因的编码的蛋白是如何肯定的？

10. 如何理解基因之间的关系，是什么性质的关系？

11. 如何当即基因的拷贝数对基因表达的影响？

12. transposable-element对基因表达的影响？

13. 基因的经典结构是什么样的？什么是CDS和UTR？能够结合目前主流的基因预测工具来看。

14. 转录调控和蛋白互做有什么联系和区别？

 

Typical structure of a mature eukaryotic mRNA (AUG, UAA/UAG/UGA)

 

 

待续~